Tôn Thất Tùng sinh ra trong một gia đính quý tộc triều Nguyễn. Cha ông là Tôn Thất Niên, Tổng đốc Thanh Hóa và mẹ là Hồng Thị Mỹ Lệ. Ông là con út và có các anh chị là: Tôn Thất Viên, Tôn Nữ Hường An, Tôn Thất Bật, Tôn Thất Văn.[4] Sau khi chồng qua đời, năm 1912, mẹ ông rời Thanh Hóa về Huế mua vườn tại thôn Dương Xuân Thượng, nay thuộc Phường Đúc và ông lớn lên tại đây.[4]

Năm 1944, Tôn Thất Tùng kết hôn cùng bà Vi Thị Nguyệt Hồ. Bà từng được xem là một hoa khôi Hà Thành và là cháu nội của Tổng đốc Hà Đông Vi Văn Định. Ông bà có với nhau 3 người con, đều theo ngành y, đó là Tôn Nữ Ngọc Trân, Tôn Nữ Hồng Tâm và người nổi tiếng nhất là Phó Giáo sư – Viện sĩ, Bác sĩ Tôn Thất Bách (1946 – 2004), nguyên Hiệu trưởng Đại học Y Hà Nội, nguyên Giám đốc Bệnh viện Việt Đức, nguyên Phó Chủ nhiệm UB các vấn đề xã hội của Quốc hội.

Trong chiến tranh Việt Nam, Tôn Thất Tùng đã từ mặt toàn bộ gia đình của ông với lý do họ theo phía bên kia.[5]